Assoziationen häufiger Variationen

Im Gegensatz zu Kandidatengen-basierten Assoziationsstudien, die hypothesengeleitet den Zusammenhang zwischen Variationen in einem plausiblen Kandidatengen und einem bestimmten Phänotypen wie z.B. der Schizophrenie untersuchen, sind genomweite Assoziationsstudien nicht auf eine Hypothese angewiesen. Durch die Untersuchung der Genotypen von mehreren hunderttausend Einzelbasenaustauschpolymorphismen (single nucleotide polymorphism, SNP) pro Person, ist es möglich, die das gesamte Genom abzudecken.

Die ersten genomweiten Assoziationsstudien zur Schizophrenie enthielten mit 178 Patienten und 144 Kontrollen (Lencz et al. 2007) sowie 738 Patienten und 733 Kontrollen (Sullivan et al. 2008) retrospektiv keine ausreichende Power, weshalb es nicht gelang, weitere positive Replikationen zu publizieren.

Die erste ausreichend große genomweite Studie wurde mit eigener Beteiligung an einer deutlich größeren Stichprobe durchgeführt. Dazu wurden in der ersten Stufe 479 Patienten und 2.937 Kontrollprobanden eingeschlossen und daraufhin die besten genetischen Variationen (Kriterium: p<10-5) bei 6.829 Patienten und 9.897 Kontrollprobanden repliziert. Von 12 so ermittelten Loci waren 3 besonders stark mit der Schizophrenie assoziiert, u.a. das Zinkfinger-Gen ZNF804A auf 2q32.1.

Diese intensive Kooperation mit der Universität Cardiff, einem der führenden Zentren auf dem Gebiet der psychiatrischen Genetik, führte bislang zu mehreren Publikationen in Nature Genetics sowie einem WTCCC2 Projekt sowie einem EU Projekt.

• 2008: Genome Wide Association Study of Schizophrenia in Ireland. Wellcome Trust, WTCCC2, PI: Dr. Aiden Corvin, Dublin, Ireland (Rujescu: Collaborator)
• 2009: EU: FP7: HEALTH: Collaborative Project, Large Scale Integrating Project: HEALTH-2009-2.2.1-2: Identifying genetic and environmental interactions in schizophrenia. European Network of National Schizophrenia Networks Studying Gene-Environment Interactions (EU-GEI) Coordinator: Prof. Jim van Os (Rujescu: Co-Applicant)

Des Weiteren führten Stefansson et al. (2009), ebenfalls im 2-Stufen-Design, unter eigener Beteiligung zunächst eine genomweite Assoziationsstudie bei 2.663 Patienten und 13.498 Kontrollprobanden aus 8 europäischen Ländern innerhalb des SGENE- Konsortiums durch. Daraufhin wurden die besten 1.500 Marker sowohl in einer unabhängigen Stichprobe des International Schizophrenia Consortiums (ISC: 2.602 Patienten / 2.885 Kontrollen) als auch in dem Molecular Genetics of Schizophrenia Consortium (MGS: 2.687 Patienten / 2.656 Kontrollen) repliziert und die besten Marker in 5.013 Patienten und 15.559 Kontrollprobanden weiterverfolgt.

Dieser Ansatz führte zur Identifikation von 3 neuen Loci für die Schizophrenie: Neurogranin (NRGN1) auf Chromosom 11q24.2, TCF4 auf Chromosom 18q21.2 und der MHC Region auf Chromosom 6p21.3-22.1 (Stefansson et al. 2009).

Interessanterweise konnten die Ergebnisse der HLA-Region unabhängig voneinander in den großen Stichproben der Konsortien: ISC (ISC 2009) und MGS (Shi et al. 2009) gefunden werden.

Darüber hinaus besteht eine enge Zusammenarbeit mit dem Institute of Psychiatry des Kings College in London, entstanden weitere Projekte, u.a. zwei WTCCC sowie zwei EU Projekte:

• 2008: A genome-wide association study of psychosis endophenotypes. Wellcome Trust, WTCCC2, PI: Prof. Robin Murray, IoP, UK (Rujescu: Co-Applicant)
• 2009: EU: FP7: HEALTH Collaborative Project, Large Scale Integrating Project: HEALTH-2009-2.2.1-3: Optimising current therapeutic approaches to schizophrenia. Optimization of Treatment and Management of Schizophrenia in Europe (OPTiMiSE) Coordinator: Prof. Rene Kahn (Rujescu: Principal Investigator of Blood-Omics and Clinical Trial)
• 2011: EU: FP7: HEALTH Collaborative Project, Large Scale Integrating Project: HEALTH-2011.1.1-2: Genome-based biomarkers for patient stratification and pharmacogenomic strategies: Pharmacogenomic biomarkers as clinical decision making tools for clozapine treatment of schizophrenia (Rujescu: Principal Investigator)

Da die Stichprobengröße als limitierender Faktor für eine ausreichende statistische Power nicht von einzelnen Arbeitsgruppen bewältigt werden konnte, wurde ein neues Konsortium gegründet, das Psychiatric Genome-Wide Association Study Consortium (PGC), welchem Prof. Dr. Dan Rujescu angehört und dessen Ziel in der Sammlung einer möglichst großen Stichprobe aus Patienten mit psychiatrischen Erkrankungen und gesunden Kontrollen besteht. Seit der Gründung des Konsortiums ist diese Arbeitsgruppe in verschiedenen thematischen Teilbereichen des Konsortiums, u.a. dem Bereich Schizophrenie involviert.

Bereits die ersten Publikationen zeugten von dem Erfolg dieser Strategie: In einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) mit 51.000 Personen europäischen Ursprungs konnten 7 Loci mit einer genomweit signifikanten Assoziation mit der Schizophrenie identifiziert werden. Darunter befanden sich 5 neue Regionen (1p21, 2q32.3, 8p23.2, 8q21.3, 10q24.32-q24.33) und zwei Regionen, für die bereits Hinweise existierten (6p21.32-p22.1, 18q21.2). Die stärkste Assoziation zeigte ein SNP in einem Intron einer Micro- RNA (MIR137), von der eine Beteiligung an der neuronalen Entwicklung angenommen wird. Zusätzlich zeigten vier potentielle Zielgene von MIR137 eine genomweite Signifikanz. Dies wurde als Hinweis auf eine Beteiligung eines bisher nicht mit der Pathophysiologie der Schizophrenie in Zusammenhang gebrachten Mechanismus gewertet. In Kombination mit einer zusätzlichen Stichprobe aus etwa 16.000 Patienten mit einer Bipolaren Störung und 14.000 Kontrollen wurden drei weitere Loci identifiziert (CACNA1A, ANK3, ITIH3-ITIH4-Region), die zu einer Suszeptibilität beider Erkrankungen beitragen (The Schizophrenia Psychiatric Genome-Wide Association Study (GWAS) Consortium 2011).

Unter Verwendung der Referenzstichprobe des 1000 Genomes Projects, Phase 1 für die Imputierung der SNPs wurden die Schizophreniedaten des PGC in 2013 in Kombination mit einer zusätzlichen Stichprobe aus Schweden im Rahmen einer Metaanalyse mit insgesamt 21.246 Patienten und 38.072 Kontrollen ausgewertet. Dabei erwiesen sich 22 Loci als genomweit signifikant, von denen fünf Loci bereits mit Schizophrenie (MHC, WBP1L/C10orf26, DPYD-MIR137, SDCCAG8, MMP16), drei Loci mit Schizophrenie und Bipolarer Erkrankung (CACNA1C, CACNB2, ITIH3-ITIH4) und ein Locus mit Bipolarer Erkrankung in Zusammenhang gebracht worden waren (NCAN). Darüber hinaus konnten 13 neue Loci (MAD1L1, TSNARE1, SNX19, QPCT, SLC06A1, ZEB2, FONG, C2orf82, AKT3, C12orf65, Loci in der Nähe von GRIA1, TCF4 und ZSWIM6) identifiziert werden. 

Eine Untersuchung der potentiellen Funktion der Gene in den Kandiatenregionen legt eine Beteiligung der neuronalen Calcium Signalkaskade, der MHC Region (höchste Signifikanz) und eine durch MIR137 beeinflusste Regulation von Zielgenen nahe. Des Weiteren ist von einem Einfluss zwischen Genen lokalisierter, nicht kodierender langer RNAs (long intergenic non-coding RNA, lincRNA) auszugehen, von denen ein Einfluss auf epigenetische sowie gen-regulatorische Mechanismen angenommen wird (Ripke et al. 2013).

Im Rahmen PGC wurde eine weitere große genomweite Assoziationsstudie an über 145.000 Kontrollen und Schizophrenie Patienten durchgeführt. Diese stellt die größte weltweite Schizophrenie-Stichprobe dar, die bahnbrechende Entdeckungen erbringen konnte. 

In dieser Analyse mit 36.989 Patienten und 113.075 Kontrollen wurden 128 Assoziationen in 108 voneinander unabhängigen Loci identifiziert. Die stärkste Assoziation zeigte die MHC-Region (p=3,48x10-31). Des Weiteren waren Assoziationen innerhalb von im Gehirn exprimierten Genen gehäuft zu finden.

Interessanterweise erreichten hier erstmals Varianten in bekannten Kandidatengenen wie dem Dopaminrezeptor 2 (DRD2) und einigen weiteren Genen aus der glutamatergen Neurotransmission (GRM3, GRIN2A, SRR, GRIA1) genomweite Signifikanz. Diese Ergebnisse bestätigten einerseits Teile der gängigen pathophysiologischen Modelle, und weisen andererseits auf Gene bzw. Genprodukte hin, von denen entweder eine therapeutische Relevanz für die Behandlung der Schizophrenie bereits bekannt ist (Die Wirkung der meisten Antipsychotika in Hinblick auf Positivsymptomatik verläuft über die Bindung am Dopamin D2 Rezeptor) oder aber die als vielversprechende Kandidaten gelten.

Das konsistenteste Ergebnis aller GWAS zur Schizophrenie ist die Assoziation mit der erweiterten MHC (major histocompatibility complex) Region, eines Bestandteils des Immunsystems auf Chromosom 6. Hinweise auf eine Beteiligung des Immunsystems an der Pathophysiologie der Schizophrenie gibt es schon sehr lange. Diese konnten in mehreren unabhängigen mittel bis sehr großen Stichproben bestätigt werden.

Neben den genomweiten Signalen aus SNP oder CNV (copy number variants) GWAS existiert eine mehr als zufällige Anzahl an nominal signifikanten Assoziationen mit der Schizophrenie. Dies liegt möglicherweise an der noch immer nicht ausreichenden Power der aktuellen Stichproben. Schätzungen der SNP-basierten Heritabilität weisen darauf hin, dass ein Teil der Variationen, die unterhalb der genomweiten Signifikanzgrenze liegen, ebenfalls zur Erkrankungswahrscheinlichkeit beiträgt. Eine Möglichkeit, hier die echten Signale herauszufiltern, liegt in der Analyse von Signalkaskaden, bei der alle beteiligten Gene in die Gewichtung einer Kaskade mit einbezogen werden.

In einer diagnoseübergreifenden Signalweganalyse, in der ca. 60.000 Probanden mit Schizophrenie, Majorer Depression, Bipolarer Störung, Autismusspektrum-Erkrankungen und Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung des PGC eingeschlossen wurden, konnte gezeigt werden, dass der stärkste Zusammenhang für die Schizophrenie mit Prozessen zu finden war, die an der synaptischen Übertragung (sowohl prä- als auch postsynaptisch) beteiligt waren, während in der übergreifenden Analyse die Signalkaskade für die Histonmethylierung im Vordergrund stand (Network and Pathway Analysis Subgroup of Psychiatric Genomics Consortium 2015).

Verschiedene Ansätze unterstützen die Hypothese, dass genomweit assoziierte Varianten ihre Effekte eher über die Regulation der Genexpression vermitteln, u.a. durch mRNA Degradation, transkriptionelle oder translationelle Verstärkung oder Stilllegung eines Gens oder durch Chromatinmodifikationen, als durch direkt Veränderung der  Proteine (z.B. Aminosäureaustausche). Diese Annahme wird u.a. dadurch gestärkt, dass sich in exombasierten Studien (Sequenzierung oder SNP Genotypisierung aller bekannten Exons im Genom) keine überzeugenden positiven Argumente für eine Anreicherung von eQTL (expression quantitative trait loci) in Risikoloci für die Schizophrenie finden ließen.

Interessanterweise überlappen die Ergebnisse aus Studien mit seltenen Varianten (CNVs) großen Effekts mit denen aus der GWAS, und zwar sowohl was die Lokalisation der chromosomalen Bereiche wie auch der funktionellen Cluster angeht, so dass davon auszugehen ist, dass beide Variantentypen relevant sind.

Der Beitrag häufiger Variationen zur genetischen Varianz der Schizophrenie wird auf etwa 30-50% geschätzt. Der Frage, warum diese Risikovarianten trotz der erhöhten Mortalität und reduzierten Nachkommenschaft bei Schizophrenie in der Allgemeinbevölkerung persistieren, wurde in einer Metaanalyse an 40.675 Patienten und 64.643 Kontrollen nachgegangen. Natürliche Selektion basiert auf verschiedenen Mechanismen, u.a. auf positiver oder negativer Selektion (direkt, oder indirekt durch Hintergrundselektion, bei der ein Verlust eines neutralen Locus aufgrund seiner Kopplung mit einem schädlichen Locus erfolgt), Erhöhung der Diversität durch Introgression z.B. von Neandertaler-DNA. Eine Analyse mittels partitionierter LD-Score Regression (LDSR) weist auf einen starken Einfluss negativer Hintergrundselektion hin. Zusätzlich konnte eine Häufung von Assoziationen in den Genen identifiziert werden, deren Funktionsverlust als fatal eingeschätzt wird (i.e. die intolerant gegenüber Mutationen sind). Des Weiteren zeigten 145 LD unabhängige Loci genomweite Assoziationen mit Schizophrenie, dabei überlappten 93 mit der bisher größten Stichprobe des PGC und 50 wurden bisher noch nicht beschrieben (Pardiñas et al. 2018).

Die Beantwortung der Frage, wie solche Variationen oder Loci zu einem erhöhten Schizophrenierisiko beitragen, ist die Aufgabe eigener weitergehender Untersuchungen in vitro oder in Modellorganismen, wobei sich hier die CNV Varianten wegen ihrer Größe und daher potentiell wesentlich deutlicheren Effekte anbieten.